液氮超低温保存技术在果树种质资源保存中的应用

目前，世界上的植物遗传基础趋向单一化，一些地方品种及珍贵稀有的作物资源也从地球上逐渐消失。因此世界各国对种质资源的收集和保存都非常重视，近几十年来，液氮超低温保存技术发展迅速，为种质资源的保存开辟了新的途径。液氮罐

1 液氮超低温保存技术原理及优点

通常将-80℃以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液态氮为冷源，使保存温度维持在-196℃。生物材料在如此低温下，新陈代谢活动基本停止，处于"生机停顿"(Suspanded animation)状态。这就有可能极大地延长储存材料的寿命，而不产生遗传变异，从而有效地、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。 利用液态氮保存植物种质，液氮冷冻容器就是液氮罐。除了1～2个月补充一次液氮外，不需要机械空调设备及其它管理，节省了大量的人力和物力。并且可以保持被保存组织及细胞培养物的遗传稳定性。因此比其它保存方法有着很大的优点。

2 基本程序

2.1 材料的准备与选择

超低温保存的材料一般选择处在指数增长的细胞材料。如愈伤组织的超低温保存一般选择培养18～24d的培养物作为材料。

2.2 预处理

使保存材料达到适合于超低温保存的生理状态。主要是提高分裂相细胞的比例的减少细胞内自由水含量。

2.3 放入冰浴

将材料装入试管或其他保存容器中，并随既插入冰浴中。

2.4 加入保护剂

加入0℃预冷冰冻保护剂，在0℃冰浴中放团置30～45min。

2.5 降温冰冻

（1）直接投入液氮。

（2）程序慢速0.05～5℃/min降温到投入液氮。

（3）慢速降温到预冻温度（-30℃），停留一段时间（1～3h）后投入液氮。

（4）逐级降温后投入液氮，如：0℃——-10℃（5min）——-15℃（5min）——-23℃（5min）——-30℃（5min）——-40℃（5min）——-196℃（液氮）。

2.6 保存后的化冻

一般在37℃～40℃温水中快速化冻。

2.7 活力鉴定

通常采用TTC法，也称氯化三苯四液唑还原法。如果是单细胞或原生质体，可以采用活性荧光素染色法，显示活细胞，统计存活率。

2.8 再培养

观察组织细胞恢复生物的速度，存活率，植株的再生能力。

2.9 遗传性状分析

植株形态特征，生长发育，染色体、同工酶谱及抗逆性等。

3 影响超低温保存效果的因素

3.1 材料的特性

包括植物的基因型，抗冻性，器官、组织和细胞怕年龄、生理状态等。这些因素对眧低温保存效果有很大的影响，从而要求在整个保存处理过程中采取相应的，符合其特性的各种适宜的措施。比如材料如果是含量有液胞小、含水量小的细胞（如茎尖分生组织等），可用用快速降温冰冻方法。含液胞大、含水量高的细胞的则一般需要采用慢速降温法律等等。

3.2 预处理

是为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性：增加细胞分裂与分化的同步化。减少细胞慛自由水的含量。增强细胞的抗寒力。主要的方法有以下几种。

3.2.1 细胞、组织继代培养中，细胞分裂分化同步化调控。L.A.Withers等指出，有丝分裂前或稍后的细胞抗冻能力强，处于这个时期的细胞在超低温保存后存活率高。

3.2.2 预培养：增加培养基中的糖浓度，提高渗透压。或者在预处理培养基中加入诱导抗寒力的物质或冰冻保存剂，如脱落酸、山梨醇、二甲亚砜等。

3.2.3 低温锻炼：一些植物如康乃馨、苹果等的茎尖在液氮保存前经过低温锻炼可以提高存活率。液氮罐

另外，有些报道中采用上述几种方法结合处理达到效果。

3.3 冰冻保护剂

作为冰冻保存剂的物质需要具备发下特性：（1）易溶于水。（2）在适当的浓度下对细胞是无毒的。（3）化冻后容易从组织细胞中少清除。常用的冰冻保护剂有二甲基亚砜、甘油、糖的糖醇为物质等。

3.4 降温冰冻方法

材料经冰冻保护剂在0℃预处理30～40min后，要立即降温冰冻，最后到达液氮中保存，降温方法是影响超低温保存效果的关键因素之一，所以它在超低温保存技术体系中一直是注意较多的一个方面。一般根据不肉中刺的保存对象有四种不同的降温就去：快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法、逐级冰冻法。

3.5 化冻方法

大量的实验证据表明，植物的冻害常常是发生在冰冻和化冻两个过程中，因此除了需要有一个合适的降温冰冻程序外，还要有一个合适的化冻方法，以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰。并防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的在破坏。一般采用快速化冻法。即将液氮保存后的材料在37-40℃的温水浴中化冻。因数超低温冰冻材料化冻时，再次结冰的危险区域是-50℃～10℃.从理论上讲可以借助迅速的化冻速度通过此温度区，从而可以避免细胞内的次生结冰。但是如果材料是木本科和冬芽，那么在超低温保存后必须在0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好效果，因为冬芽已经经过低温锻炼，细胞内的水分已经在限度地流到细胞外结冰，快速化冻时会受到猛烈的渗透冲击，从而会导致细胞膜的破坏，因此需要慢速解冻

4、在果树质资源保存中的应用

4.1 花粉

最早在1922年，H.E.Knowlton就已经在金鱼草花粉方面取得了一害的成功。他把金鱼草花粉冷冻到-180℃后，仍然获得了一定程度的花粉的超低温成功保存已有许多报道。已经取得成功的有桃、李、木瓜、枣椰、鳄梨、胡桃等许多树种。日本的Yatabe果树试验站利用超低温保存技术已经保存了桃的60个栽培品种和品系的花粉，时间已达十年以上。

4.2 种子

种子在-18℃，含水量（5+1）%的情况下其新陈代谢仍然发生，导致生活力衰退。特别是执拗型种子的寿命更短，难以保存。超低温保存技术可以克服这些不利因素，使种子保存更为长久。目前果树方面利用超低温保存种子有柠檬、海棠等。

4.3 枝条、芽及茎尖分生组织

由于茎尖分生组织细胞分化程度小，倍性一致辞，遗传上比较稳定，且在离体条件下容易再生新植株，因此，茎尖的种质保存意义重大。枝条、芽也是保存无性繁殖植物种质的方便途径。1978年日本学者就已报道了苹果、梨、醋栗等果树冬芽超低温保存的成功。此后在苹果、草莓等果树茎尖保存中也取得了成功。

4.4 幼胚及胚状体

单倍体细胞在遗传上是不稳定的，超低温保存将是保持单倍体稳定性的有效途径。据Y.P.S.Bajiaj报道，柑桔的珠心胚经过液氮保存后存活率为24%～28%。

4.5 组织及细胞

愈伤组织及悬浮培养细胞的超低温保存也是果树种质资源保存的一个有途径。在酸樱桃、甘蔗、草莓等的愈伤组织及悬浮培养细胞的超低温保存方面取得成功。

4.6 原生质体

原生质体具有多种用途，特别是在开辟果树育种方面有着广阔的前景，它是进行细胞杂交和基因工程的基础材料。对原生质体的超低温保存有着更大的优越性：与具有细胞壁的细胞相比，它降低了冰冻的危害，能得到更高的存活率。但是原生质体的超低温保存要求较高，果树原生质体的超低温保存报道较少。马峰旺等（1998）报道，杏的一些品种的悬浮培养物分离的原生质体超低温保存后成活率可达40%。液氮罐

超低温保存技术在种质资源保存方面已经取得了很大的成就，相信随着超低温技术的发展，在这一方面的应用会愈加成熟，这一技术也必将为保持地球生态多样性作出更大的项献。