不同复温方法对液氮保存人同种瓣活性影响的实验研究

目的：寻找一种能最大程度保持液氮贮存人同种主动脉瓣活性的复温方法。自增压液氮罐
方法：同种主动脉瓣(n=36)随机分为6组，Ⅰ组为新鲜同种主动脉瓣，Ⅱ～Ⅵ组经液氮保存3月后，分别采用①42℃水浴复温(Ⅱ组)，②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ组)，③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ组)，④(10.0±2.0)℃/min(Ⅴ组)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ组)。将同种主动脉瓣复温至4℃，对所有同种主动脉瓣进行台盼蓝染色活细胞计数、24小时葡萄糖代谢率测定，氚化胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)参入、瓣膜组织培养。
结果：上述指标Ⅰ组显著优于其余各组(P＜0.05)，Ⅳ组优于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组(P＜0.05)。组织培养Ⅰ组细胞生长优于其余各组，且早于各组3～4天。
结论：不同复温方法对同种主动脉瓣活性影响不同，以4℃/min匀速复温法对同种主动脉瓣活性影响最轻。

关键词：同种 主动脉瓣 活性

　　我们通过本研究观察不同复温方法对同种瓣活性的影响，旨在寻找一种能较好保持同种瓣活性的复温方法，为临床合理应用同种瓣提供依据，现报道如下。

材料与方法
　　1.取材分组　于1995年10月～1996年5月选择46例健康成人脑死亡者，于死亡30分钟内，在无菌条件下取出心脏，随机抽取36例(年龄20岁～32岁，平均26岁)分为6组(n=36)。4℃生理盐水
冲洗、修剪，保留主动脉瓣，插入铜-康铜热电偶测量电极，将同种瓣置入含万古霉素(50mg/L)、二性霉素(25mg/L)的RPMI1640液，经4℃过渡2小时后移入液氮气相中放置2小时，然后置入液氮中，保存3月后取出，分别以①42℃水浴复温(Ⅱ组)；②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ组)；③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ组)；④(10.0±2.0)/min(Ⅴ组)；⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ组)的速率将同种瓣复温至4℃，新鲜未冷冻同种瓣对照(Ⅰ组)。
　　2.温度测量控制装置与方法　根据升降式降温仪原理，自制复温装置，如图1所示。

图1　升降式温度测量控制装置
1　液氮容器　2　铜-康铜热电偶
3　同种瓣保存袋　4　液氮　5　旋转升降器　6　冰瓶
7　植物油　8　标准探极　9　冰水　10　数字式万用电表

　　3.测量探极置于同种瓣叶内，标准探极插入冰水瓶，测量两探极之间电势差，依公式与摄氏温度换算。根据复温速度要求，将含有同种瓣材料的托盘，通过细绳由旋转升降器牵引上升，利用万用电表显示电势差，控制升降速率。换算公式：U=0.0385t+0.00004t2-5.4295×10-8t3，其中U为电势差值(单位：mV)，t为摄氏温度值(单位：℃)。
　　4.实验方法　①台盼蓝染色法：0.25%胰酶消化剪碎的主动脉瓣叶，270目纤维滤膜过滤，滤液1200转/分离心15分钟，弃上清液，按1∶1将5%台盼蓝加入细胞悬液，光学显微镜计数。②葡萄糖代谢率测定：每10mg瓣膜组织中加入RPMI1640液1ml，在37℃、5%CO2孵箱中孵育24小时后用自动生化分析仪作葡萄糖定量测定。代谢率［mmol/(mg．24h)］其中RPMI1640液原液同条件下葡萄糖定量为11.3mmol/L。③氚化胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)参入量：瓣叶组织在孵育中加入3H-TdR 2μci，24小时后取出瓣叶，经漂洗后加入2mol/L NaOH，加热将其溶解，加入闪烁液10ml，用自动液闪计数仪计数(CPM)。3H-TdR参入量［CMP/(mg．24h)］=，其中RPMI1640原液本底为27CPM。④组织培养：以组织块贴壁方法在37℃、5%CO2孵箱中RPMI1640培养液培养，每周换液2次，每次半量，待组织块周边有细胞长出后，拍照。
　　5.统计学方法　台盼蓝染色活细胞百分率行组间χ2检验，葡萄糖代谢率及3H-TdR参入量以Image12.gif (851 bytes)±s表示，行组间t检验，P＜0.05差异有显著意义。

结　果
　　台盼蓝拒染细胞百分率、葡萄糖代谢率及3H-TdR参入量结果见表1。表1显示：Ⅱ～Ⅵ组活细胞百分率(主要为内皮细胞)显著低于Ⅰ组(P＜0.05)；而Ⅳ组又显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组(P＜0.05)；Ⅰ组葡萄糖代谢率、3H-TdR参入量显著高于其它各组(P＜0.05)，Ⅳ组又显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组(P＜0.05)。组织培养Ⅰ组细胞生长优于其余各组，且早3～4天。Ⅱ～Ⅵ组培养，Ⅳ组细胞生长优于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ组。

讨　论
　　同种瓣形态结构的完整决定着其耐久性。瓣膜冷冻保存不同于单细胞，由于细胞成分多样，细胞间质存在，在复温过程中，使热量交换不均匀，外周组织内冰晶融化可从内部吸收热量，使内部组织再结晶加重，可造成细胞严重的机械性损伤。另外，低温蛋白质的变性，脂质的丢失，细胞膜通透性的改变以及细胞膜上小孔的形成，使水分子易通过细胞膜，引起细胞内水负荷加重，超过一定时间或程度时，细胞便会破裂。本研究结果发现，不同复温速率对液氮保存的同种瓣均有损害。临床上常用的42℃水浴复温法，其复温速率不均匀，细胞损害重，活性低，可能与细胞再结晶重，高水负荷状态持续时间长有关。30℃/min和10℃/min复温，温差大，细胞内再结晶重。1℃/min复温，虽然再结晶轻，但细胞内高水负荷持续时间长，细胞损害亦重。4℃/min复温方法较好地保持了细胞活性，可能与热交换时间充裕，再结晶轻，细胞内高水负荷状态未超临界值有关。自增压液氮罐