工业微生物菌种的保藏方法

摘要：菌种是主要的生物资源，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。

本文介绍了常用的微生物菌种的保藏方法:斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、冷冻真空干燥保藏法、液氮超低温保藏法和基因工程菌的保藏，并比较了它们的优缺点。

关键词：微生物;菌种;保藏

菌种是一个国家的重要自然资源，菌种保藏工作是一项重要的微生物学基础工作，菌种保藏工作者的任务是把从自然界分离得到的野生型或经人工选育得到的用于科学研究和工业生产等方面的优良菌种、菌株，用各种适宜的方法妥善保存，使之达到不死、不衰、不变异、不污染，在长时间内保持原有的生产性状和生命活力，以便于科学研究和生产使用。

1、保藏菌种用培养基

为了有效地保藏微生物菌种，首先需要有良好的培养基。因此，研究选用适宜的培养基是微生物菌种保藏最基本的工作。例如，ATCC(美国的一个微生物菌种保藏机构)在1970年以前采用的培养基有498种，1974年有724种，1978年达到1006种，平均每年增加60多种。自增压液氮罐

2、微生物菌种保藏的基本原理

人们在长时间的工作实践中，根据微生物的不同要求，在菌种保藏工作中不断摸索出各种方法。无论何种保藏方法，主要是根据微生物生理、生化特点,人工创造条件,使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥、缺氧三者,此种条件,可使菌株很少发生突变以达到保持纯种的目的。

3、微生物菌种的保藏方法

3.1　斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至4～6℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。

此法的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡，培养时间长，生产性能衰退。成熟进行保藏，效果较好。

优点是操作简单，能随时检。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多。

3.2　液体石蜡保藏法

亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。

(1)液体石蜡的准备:选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌:①121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。②160℃干热灭菌2h，冷却后，经无菌检查后备用。

(2)斜面培养物的制备:将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

(3)灌注石蜡:用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。

(4)保藏:将试管直立，置低温(4～6℃)干燥处或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

3.3　滤纸保藏法

(1)将滤纸剪成0.5cm×1.2cm的小条，装入0.6cm×8cm的安瓿管中，每管1～2张，塞以棉塞，121℃灭菌30min。

(2)养1～2mL滴加在灭菌培养皿，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

(4)用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

(5)将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

(6)将棉花塞入管内，用火焰熔封管口，保存于低温下。

(7)需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14～17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

3.4　沙土保藏法

(1)取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中的有机质。

(2)倒去酸水，用自来水冲洗至中性。自增压液氮罐

(3)烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

(4)另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红的时间还要长)。保藏时间2～10年。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。

(5)恢复培养:恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。

此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

(5)烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

(6)按一份黄土、三份沙的比例(或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)掺合均匀，装入10mm×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，121℃湿热灭菌30min，烘干。

(7)进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48h，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。

(8)选择培养成熟的(一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好)优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

(9)每支沙土管中加入约0.5mL(一般以刚刚使沙土润湿为宜)孢子悬液，以接种针拌匀。

(10)放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12h内抽干。

(11)每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。

(12)若经检查没有问题，，箱或室内干燥处保存。情况。

(13)需要使用菌种，，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。

3.5　冷冻真空干燥保藏法

(1)安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15～20min，备用。

(2)准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24～48h的培养物;酵母需培养3d;形成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培养7～10d。

(3)制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，和脱脂牛乳2mL左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2mL。

(4)冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4～5min，即可使悬液结冰。

(5)将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8～20h。

(6)将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。

(7)保藏:安瓿管应低温避光保藏。

(8)质量检查:冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

(9):酒精棉花擦拭安瓿上部，在顶部，用挫刀或镊子颈部轻叩一，，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。

此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽孢菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。

3.6　液氮冷冻保藏法

(1)用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净，121℃下高压灭菌15～20min，备用。

(2)保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10%～20%甘油。

(3)微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。

菌种的准备可采用下列几种方法:①刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内。②接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内。③将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块(直径约5～10mm)，真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内;在小安瓿管中装1.2～2mL的琼脂培养基，接种菌种，培养2～10d后，加入保护剂，待保藏。

(4)预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。

(5)保藏:将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。

(6)复苏方法:从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38～40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50～10s。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

3.7　基因工程菌的保藏

3.7.1　穿刺保藏法

使用容量为2～3mL并带有螺口旋盖和橡皮垫圈的玻璃小瓶，加入相当于约2/3脂，旋上盖子，但并不拧紧，min。，冷却至室温后拧紧盖子。

保藏细菌时，用一灭菌的接种针挑取良好的单菌落，把针穿过琼脂直达瓶底数次，盖上瓶盖并拧紧，在瓶身和瓶盖上均做好标记，室温下存放于暗处。(更加广为接受的做法是将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，然后拧紧瓶盖并加封膜，最好于4℃或于室温避光保藏。

穿刺法可保藏细菌2年之久。

3.7.2　甘油管冷冻保藏

(1)在液体培养基中生长的细菌培养物的保藏取细菌培养物，加入灭菌甘油(甘油应在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20min)振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移至标记好的、带有螺口和空气密封圈的保存管内，在乙醇-干冰或液氮中冻结后转至-70℃长期保存。复苏菌种时，用灭菌的接种针刮拭冻结的培养物表面，然后立即把粘附在接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，冻干保存的菌种管重置于-70℃，而琼脂平板于37℃培养过夜。自增压液氮罐

(2)在琼脂平板上生长的细菌培养物的保存

从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mLLB的无菌试管内，再加入等量的含有30%灭菌甘油的LB培养基，振荡混合物使甘油完全分布均匀后，分装于带有螺口盖和空气密封圈的无菌试管中，按上述方法冰冻保存。

甘油管冷冻保藏法可保藏10年以上，若实验室不具备-70℃冰箱，也可把菌种放入-20℃冰箱中保藏，可保藏1年左右。

4、 总结

最好是每株菌种都采用两种以上的保藏方法，并根据保藏菌种的保质期，每隔一定时间，进行入藏菌种的复活检验和更新。