样本保存方法及冷冻胁迫对蝗虫基因组DNA提取的影响

以亚洲小车蝗为研究材料，提出了使用液氮保存蝗虫样本的有效方法，并用基因组DNA提取试剂盒分别对液氮速冻后保存、直接冷冻、无水乙醇保存和干制蝗虫标本进行了基因组DNA的提取和电泳检测。

　　1材料与方法

　　1.1供试昆虫

　　本试验研究的昆虫样本为亚洲小车蝗成虫，均采自内蒙古锡林郭勒盟多伦县农牧交错区草原，用养虫笼活体带回实验室进行处理保存。液氮罐厂家

　　1.2液氮速冻处理

　　取10头活的亚洲小车蝗单头装入离心管中，将离心管放入液氮中速冻处理3min，取出后在室温条件下放置12h观察亚洲小车蝗存活情况。

　　1.3样本保存方法

　　1.3.1液氮速冻后保存

　　将采集带回实验室的活体蝗虫样本单头装入离心管中，将离心管放入液氮中速冻处理3min，取出后放入-40℃冰箱中保存备用。

　　1.3.2直接冷冻保存

　　将采集带回实验室的活体蝗虫样本单头装入离心管中，直接放入-40℃冰箱中保存备用。

　　1.3.3乙醇保存

　　将采集带回实验室的活体蝗虫样本放入无水乙醇(分析纯)中保存备用。

　　1.3.4干制标本

　　将采集带回来的活体亚洲小车蝗样本放入毒瓶中毒死后，针插保存于标本室中，待风干后进行DNA提取试验。

　　1.4DNA的提取

　　将上述4种方法保存的蝗虫样本在3个月后进行DNA提取试验。分别选用单头亚洲小车蝗的后足股节，无水乙醇(分析纯)保存的蝗虫后足股节需在提取之前先用无菌去离子水冲洗2～3次，将蝗虫股节放入研钵中用液氮研磨成粉并移入1.5mL离心管中，然后使用天根dp304动物基因组DNA提取试剂盒参照说明书步骤进行基因组DNA提取。

　　1.5DNA电泳检测

　　用1%的琼脂糖凝胶电泳对提取的蝗虫基因组DNA进行检测。取DNA样品3μL、上样缓冲液2μL混匀后加入凝胶时预留的点样孔中，加入DL2000Marker(TaKaRa;第3条带为150ng/μL)，经过100V恒压电泳20min，使用紫外凝胶成像系统观察基因组DNA提取情况并拍照保存。

　　2结果与分析

　　2.1液氮速冻处理对样本保存的影响

　　液氮速冻处理的10头亚洲小车蝗样本在12h内均无存活迹象。说明通过液氮速冻处理能够使亚洲小车蝗活体样本迅速死亡，从而消除因逆境胁迫造成的样本本身生理生化变化，避免了这些变化对蝗虫样本基因组DNA提取产生可能的不利影响。

　　2.2不同保存方法对基因组DNA提取影响

　　亚洲小车蝗经基因组DNA提取后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1～3。液氮速冻后保存和无水乙醇保存的样本提取的基因组DNA电泳条带清晰，说明得到的DNA浓度较大;直接冷冻保存的样本提取的DNA电泳检测结果显示条带整齐，但亮度较低，说明得到的DNA浓度较小;蝗虫干标本提取的基因组DNA电泳检测显示条带不清楚，并有明显拖尾现象，有的甚至看不到条带，说明干制标本保存会导致蝗虫基因组DNA发生严重降解，会对下一步基因扩增、分子标记等分子生物学试验的进行造成不利的影响。液氮罐厂家

[液氮速冻实验对照.png]

　　2.3冷冻胁迫对基因组DNA提取影响

　　对比液氮速冻后保存和直接冷冻保存两种样本保存方法对蝗虫基因组DNA提取结果可以看出，液氮速冻后保存的样本提取的基因组DNA明显比直接冷冻保存的样本基因组DNA的电泳条带亮度高，说明液氮速冻后保存得到的DNA的浓度较大。由此得出，样本在受到冷冻胁迫死亡的过程中会发生基因组DNA降解现象，使提取得到的DNA的浓度较小。所以，液氮速冻后保存更适合昆虫基因组学的研究。

　　实验结果：在保存3个月后，检测蝗虫样本直接冷冻法和干标本提取的总DNA浓度较低，因而琼脂糖电泳检测亮度低;液氮速冻后保存和无水乙醇保存的蝗虫样本提取的基因组DNA浓度大。表明液氮速冻后保存和无水乙醇保存的标本适合用于基因组学研究。通过对比，直接冷冻保存与液氮速冻保存结果得出，蝗虫在冷冻胁迫死亡的过程中有DNA降解发生。