研究猪胚胎多能样干细胞分离培养的方法

猪胚胎干细胞分离培养自我更新和分化潜能，利用不同培养条件，从孤雌胚胎、细胞核移植胚胎和体内受精胚胎中分离样细胞。液氮容器

1.细胞培养用于核移植供体的猪胎儿成纤维细胞

从初生猪仔的耳部分离得到。细胞培养基为DMEM，15%胎牛血清，培养温度为37℃，5%CO2。细胞冻存，使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化，中和后离心200Xg，5min。将细胞重悬后并加入等量冻存液(40%DMEM，40%FBS和20%DMSO)，贮存在液氮中。

2.卵母细胞的收集和准备

从屠宰场收集猪卵巢，保存在含有青/链霉素的生理盐水中，运输温度32~38℃，3h内运回实验室。采用抽吸法采集卵巢卵母细胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母细胞置于15mL离心管中，37℃水浴静置数分钟，待卵母细胞沉降后，用洗卵液洗2遍，显微镜下挑取颗粒细胞层达3层以上的卵丘卵母细胞复合物(cumulusoocytecomplex，COCs)，然后将COCs转入U型皿中培养42~44h，每孔加500µL成熟培养液，每孔放置50~70枚。

3.孤雌激活和胚胎培养

用电融合仪将成熟的卵母细胞进行电激活，漂洗后，将卵母细胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分别将卵母细胞转移到胚胎培养基G1、NCSU23和猪受精卵培养基，24h后记录卵裂率。3d后，将培养基G1中发育的胚胎移入囊胚培养基G2。再次培养3~4d后，统计囊胚个数并收集。

4.体细胞核移植胚胎培养

去除成熟卵母细胞第一极体，随后注入供体细胞。显微操作后，移入含10%FBS的M199培养基，在38.5℃，5%CO2条件下孵育0.5h，使用电融合仪进行激活处理，移入6D孵育2.5h后，将重组胚胎在NCSU23培养基中培养3d，随后替换NC-SU23继续培养3~5d，观察胚胎的发育。

5.体内胚胎的收集

从人工受精的母猪体内收集第7~8d的囊胚，所有方法参照Stokes等（2005)。每天监测母猪的发情，将发情日期作为0d，鉴定发情后的6、12和18h进行人工受精。从子宫冲洗胚胎时使用预热的含10%FBS的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersa-line，PBS)。

6.从猪胚胎分离胚胎多能干细胞

将去除透明带的囊胚接种到丝裂霉素C(mi-tomycin-C)处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblastcells，MEFs)饲养层上2~4d，囊胚内细胞团(innercellmass，ICM)在3~5d后出现。待ICM大小适中时，用机械法分离细胞，重铺到新的饲养层上，并使用不同的猪胚胎干细胞(por-cineembryonicstemcells，pESCs)培养基(ESM1~ESM6，表1)，胚胎多能干细胞克隆每5~7d使用机械法传代。液氮容器

7.免疫荧光检测

使用4%多聚甲醛固定胚胎10min，PBS洗2次后，加入0.25%Triton-X室温30min，PBS洗3次，1%BSA室温封闭1h，4℃孵育一抗24h(1∶200，CDX2;1∶200NANOG)。PBS冲洗3次，孵育荧光标记的二抗(1∶1000)室温1h。PBS冲洗2次后，DAPI染色2min，PBS冲洗2次后在荧光显微镜下观察照相。

8.qRT-PCR

使用0.5%链霉蛋白酶A去除猪胚胎的透明带后，立刻加入5μL的裂解缓冲液(5mmol/L二硫苏糖醇，1%NP-40，1U/uLRNA酶抑制剂)，冰上孵育30min。使用反转录试剂盒将裂解液反转录为cDNA。qRT-PCR体系：cDNA2μL，SYBRgreenmix12.5μL，上下游引物各0.3µmol/L0.5μL，ddH2O补充到25μL。反应程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40个循环。