工业微生物菌种的保藏方法

菌种是一个国家的重要自然资源， 菌种保藏工 作是一项重要的微生物学基础工作， 菌种保藏工作者的任务是把从自然界分离得到的野生型或经人工 选育得到的用于科学研究和工业生产等方面的优菌种 、 菌株，用各种适宜的方法妥善保存， 使之达到 不死、 不衰 不变异 、 不污染，在长时间内保持原有的生产性状和生命活力，以便于科学研究和生产使用。　自增压液氮罐　

1　 微生物菌种保藏的基本原理　　
人们在长时间的工作实践中， 根据微生物的不 无论何种保藏方法，主要是根据微生物生理 、 生化特同要求，在菌种保藏工作中不断摸索出各种方法。　　

2      保藏菌种用培养基　　
为了有效地保藏微生物菌种， 首先需要有良好的培养基。因此， 研究选用适宜的培养基是微生物 菌种保藏最基本的工作。例如，ATCC (美国的一个 微生物菌种保藏机构) 在 1970 年以前采用的培养基 有 498 种，1974 年有 724 种，1978 年达到 1006 种，平 均每年增加 60 多种。　　

3　 微生物菌种的保藏方法　　
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上， 待菌 充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好， 移至 4 ～ 6 ℃ 的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌 、 放线 菌及有芽孢的细菌保存 2～4 个月，移种一次。酵母 菌两个月，细菌最好每月移种一次。斜面菌种应保 藏相继三代培养物以便对照， 防止因意外和污染造 成损失。 此法的培养时间和培养温度影响其保藏质量。 培养时间过短，保存时容易死亡， 培养时间长， 生产 性能衰退。一般以稍低于生长最适温度培养至菌种 成熟进行保藏，效果较好 [6 ]。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法， 优 点是操作简单，使用方便， 不需特殊设备， 能随时检 查所保藏的菌株是否死亡 、 变异与污染杂菌等。缺 点是容易变异，因为培养基的物理 、 化学特性不是严 格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响 微生物的性状 ; 污染杂菌的机会亦较多。　　

液体石蜡保藏法

亦称矿物油保藏法， 定期移植保藏法的辅助方 法。
(1) 液体石蜡的准备 : 选用优质化学纯液体石 蜡，将液体石蜡分装加塞， 用牛皮纸包好， 采用以下 两种方式进行灭菌 : ①
121 ℃湿热灭菌 30 min， 置 40 ℃ 恒温箱中蒸发水分， 经无菌检查后备用。 ② 160 ℃ 干热灭菌 2 h，冷却后，经无菌检查后备用。
(2) 斜面培养物的制备 : 将需要保藏的菌种， 在 最适宜的斜面培养基中培养， 使得到健壮的菌体或 孢子。
(3) 灌注石蜡 : 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石 蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1 cm 为准，使菌种与空气隔绝。
(4) 保藏 : 将试管直立，置低温 (4～6 ℃ 干燥处 ) 或室温下保存 (有的微生物在室温下比冰箱中保存保藏 2 年以上不死， 酵母菌可保藏 1 ～ 2 年， 一般无 芽孢细菌也可保藏 1 年左右， 甚至用一般方法很难 保藏的脑膜炎球菌， 在 37 ℃ 温箱内， 亦可保藏 3 个 月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且 不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置， 所占 位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培 养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与 残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

滤纸保藏法
(1) 将滤纸剪成 0. 5 cm × 2 cm 的小条， 装入 1.0. 6 cm × cm 的安瓿管中，每管 1～2 张，塞以棉塞， 8 121 ℃ 灭菌 30 min。
(2) 需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。 (3) 灭菌脱脂牛乳 1 ～ 2 mL 滴加在灭菌培养皿 或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。
(4) 用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液 内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
(5) 将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的 干燥器中，用真空泵抽气至干。
(6) 将棉花塞入管内， 用火焰熔封管口， 保存于 低温下。
(7) 需要使用菌种， 复活培养时， 可将安瓿管口 在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破 裂，再用镊子敲掉口端的玻璃， 待安瓿管开启后， 取 出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。 细菌 、 酵母菌 、 丝状真菌均可用此法保藏， 前两 者可保藏 2 年左右， 有些丝状真菌甚至可保藏 14 ～ 17 年之久。此法较液氮 、 冷冻干燥法简便， 不需要 特殊设备。　　

沙土保藏法
(1) 取河沙加入 10 %稀盐酸， 加热煮沸 30 min，以去除其中的有机质。
(2) 倒去酸水，用自来水冲洗至中性。
(3) 烘干，用 40 目筛子过筛， 以去掉粗颗粒， 备 用
(4) 另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红的时间还要长 )。保藏时间 2 ～ 10 年。保藏期间应 定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液 体石蜡。
(5) 恢复培养 : 恢复培养时， 挑取少量菌体转接 在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一 次。 此法实用而效果好。霉菌 、 放线菌 、 芽孢细菌可土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。
(5) 烘干，碾碎，通过 100 目筛子过筛， 以去除粗 颗粒。
(6) 按一份黄土 、 三份沙的比例 (或根据需要而 用其他比例， 甚至可全部用沙或全部用土 ) 掺合均 匀，装入 10 mm × mm 的小试管或安瓿管中，每管 100 装 1 g 左右，塞上棉塞，121 ℃ 湿热灭菌 30 min，烘干。
(7) 进行无菌检查，每 10 支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37 ℃ 培养 48 h，若仍有杂菌， 则需全部重新灭菌， 再作无菌试验， 直至证明无菌， 方可备用。
(8) 选择培养成熟的 (一般指孢子层生长丰满 的，营养细胞用此法效果不好 ) 优良菌种， 以无菌水 洗下，制成孢子悬液。
(9) 每支沙土管中加入约 0. 5 mL (一般以刚刚 使沙土润湿为宜) 孢子悬液，以接种针拌匀。
(10) 放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽 干时间越短越好，务使在 12 h 内抽干。
(11) 每 10 支抽取一支， 用接种环取出少数沙 粒，接种于斜面培养基上， 进行培养， 观察生长情况 和有无杂菌生长， 如出现杂菌或菌落数很少或根本 不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样 检查。
(12) 若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰 箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌 情况。
(13) 需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移 入液体培养基内，置温箱中培养。


此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌 、 放线 菌，因此在抗生素工业生产中应用最广， 效果亦好， 可保存 2 年左右，但应用于营养细胞效果不佳。　　以上各法可根据实验室具体条件与需要选用， 最好是每株菌种都采用两种以上的保藏方法， 并根 据保藏菌种的保质期，每隔一定时间，进行入藏菌种 的复活检验和更新。自增压液氮罐