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无细胞百日咳攻击菌的制备及液氮保存材料和方法
时间:2019-05-13 10:29来源: 作者:班德液氮罐 点击:
次
1、 材料 自增压液氮罐
1.1分装容器
冻存管：4306592.0ml corning incorporated，cor-ning，NY14831 Made in Mexico。
1.2保护剂及培养基
甘油：分析纯。
蛋白胨水、活性炭半综合培养基和改良包-姜羊血培养基，由长春生物制品研究所培养基室提供。
1.3菌种
百日咳攻击菌种株18323由中国药品生物制品检定所提供。
2、方法
2.1攻击菌的制备
2.1.1 菌种复苏及传代 将菌种在无菌条件下复苏、溶解、混匀、传到包$姜羊血培养基中，37℃培养72h，同时作纯菌试验。合格后传二代经37℃培养48h，用活性炭半综合培养基传三代、四代、五代、六代、七代、八代、九代，37℃培养24h。
2.1.2保护剂的制备 将甘油加入蛋白胨水中制成含10%甘油的蛋白胨水，混匀灭菌。
2.1.3 菌悬液的制备 将各代菌液分别刮入装有ph7.2缓冲生理氯化钠溶液的大试管中，制成菌悬液并混匀，同时作纯菌试验，测定菌液浓度。
2.2攻击菌的分装
将菌悬液用含10%甘油的蛋白胨水稀释至27亿/ml，分装于灭菌的冻存管中，每管1.5～1.8ml。
2.3攻击菌保存
为防止细胞急剧冷冻后在细胞内形成冰晶，降低存活率，所以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。然后迅速放入液氮保藏器内的-150℃气相中，最后浸入到-196℃液氮中。
2.4攻击菌的检定
2.4.1攻击菌复苏 将冻存管从液氮罐中取出立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。
2.4.2攻击菌稀释 打开冻存管，将攻击菌用生理氯化钠溶液稀释成每稀释度含80000、8000、800、80和8个菌。
2.4.3攻击途径及剂量 每稀释度（0.03ml）脑腔攻击10只小鼠，每稀释度分别攻击80000个菌、8000个菌、800个菌、80个菌、8个菌。自增压液氮罐
1.1分装容器
冻存管：4306592.0ml corning incorporated，cor-ning，NY14831 Made in Mexico。
1.2保护剂及培养基
甘油：分析纯。
蛋白胨水、活性炭半综合培养基和改良包-姜羊血培养基，由长春生物制品研究所培养基室提供。
1.3菌种
百日咳攻击菌种株18323由中国药品生物制品检定所提供。
2、方法
2.1攻击菌的制备
2.1.1 菌种复苏及传代 将菌种在无菌条件下复苏、溶解、混匀、传到包$姜羊血培养基中，37℃培养72h，同时作纯菌试验。合格后传二代经37℃培养48h，用活性炭半综合培养基传三代、四代、五代、六代、七代、八代、九代，37℃培养24h。
2.1.2保护剂的制备 将甘油加入蛋白胨水中制成含10%甘油的蛋白胨水，混匀灭菌。
2.1.3 菌悬液的制备 将各代菌液分别刮入装有ph7.2缓冲生理氯化钠溶液的大试管中，制成菌悬液并混匀，同时作纯菌试验，测定菌液浓度。
2.2攻击菌的分装
将菌悬液用含10%甘油的蛋白胨水稀释至27亿/ml，分装于灭菌的冻存管中，每管1.5～1.8ml。
2.3攻击菌保存
为防止细胞急剧冷冻后在细胞内形成冰晶，降低存活率，所以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。然后迅速放入液氮保藏器内的-150℃气相中，最后浸入到-196℃液氮中。
2.4攻击菌的检定
2.4.1攻击菌复苏 将冻存管从液氮罐中取出立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。
2.4.2攻击菌稀释 打开冻存管，将攻击菌用生理氯化钠溶液稀释成每稀释度含80000、8000、800、80和8个菌。
2.4.3攻击途径及剂量 每稀释度（0.03ml）脑腔攻击10只小鼠，每稀释度分别攻击80000个菌、8000个菌、800个菌、80个菌、8个菌。自增压液氮罐
